Η πλέον αποφασιστική μάχη που έδωσε ο Μέγας Αλέξανδρος εναντίον των Περσών. Συνήφθη την 1η Οκτωβρίου 331 π.Χ. στα Γαυγάμηλα, μία πεδινή περιοχή, την οποία μπορούμε να την προσδιορίσουμε σήμερα μεταξύ Μοσούλης και Αρμπίλ στο Ιράκ.
Μετά τη νίκη του επί του Δαρείου στην Ισσό (333 μ.Χ.), ο Αλέξανδρος δεν επεδίωξε να καταδιώξει τον πέρση βασιλιά. Αντ’ αυτού, πορεύθηκε προς το Νότο, κατά μήκος των παραλίων της Μεσογείου, και στη συνέχεια προς τη Συρία. Τότε έστειλε τον Παρμενίωνα να καταλάβει τη Δαμασκό, όπου εφυλάσσοντο οι θησαυροί της Αυτοκρατορίας. Οι θησαυροί αυτοί ήταν απολύτως αναγκαίοι στους Μακεδόνες, καθώς θα έλυναν τα οικονομικά προβλήματα της εκστρατείας.
Ο Δαρείος, από την πλευρά του, έστειλε απεσταλμένους στον Αλέξανδρο, με σκοπό να τον πείσουν να αφήσει ελεύθερη τη βασιλική οικογένεια, η οποία είχε συλληφθεί μετά τη Μάχη της Ισσού και να συναφθεί ειρήνη. Ο Αλέξανδρος τους υπενθύμισε ότι είχε έλθει στην Ασία για να τους τιμωρήσει για τα αδικήματα που είχαν διαπράξει οι πρόγονοί τους κατά των Ελλήνων και τους επισήμανε ότι αν ο Δαρείος ήθελε κάτι, καλά θα έκανε να έλθει αυτοπροσώπως και να το ζητήσει από τον «Βασιλιά της Ασίας», όπως αποκαλούσε τον εαυτό του.
Ο Δαρείος έστειλε νέα πρεσβεία, με σκοπό να του προσφέρει 10.000 τάλαντα για την απελευθέρωση της οικογένειάς του και να του παραχωρήσει την έκταση από τον Ευφράτη ως τα μεσογειακά παράλια. Ο Αλέξανδρος απέρριψε την πρόταση. Αναφέρεται, μάλιστα, ότι ο στρατηγός του, Παρμενίων, του είπε: «Εγώ θα δεχόμουν, αν ήμουν ο Αλέξανδρος». Και ο Αλέξανδρος του απάντησε: «Και εγώ θα δεχόμουν, αν ήμουν ο Παρμενίων». Στη συνέχεια, ο Αλέξανδρος βάδισε κατά της Αιγύπτου, την οποία κατέλαβε χωρίς μεγάλη αντίσταση και ίδρυσε την Αλεξάνδρεια το 331 π.Χ.
Αφού απέτυχε να εξευμενίσει τον Αλέξανδρο, ο Δαρείος κατάλαβε ότι μόνο με τα όπλα θα μπορούσε να υπερασπίσει τη θνήσκουσα αυτοκρατορία του. Συγκέντρωσε μια τεράστια στρατιωτική δύναμη, αποτελούμενη από 1.000.000 πεζούς και 40.000 ιππείς, αν και οι αριθμοί αυτοί είναι υπερβολικοί… Το σίγουρο είναι ότι ήσαν πολυπληθέστεροι των Μακεδόνων και των συμμάχων τους, που αριθμούσαν 40.000 οπλίτες και 7.000 ιππείς. Στο στρατό του Δαρείου συμμετείχαν 20.000 έλληνες μισθοφόροι, ενώ δρεπανηφόρα άρματα και 50 πολεμικοί ελέφαντες συμπλήρωναν τον βαρύ οπλισμό του.
Ο Δαρείος διάλεξε την ανοιχτή πεδιάδα των Γαυγαμήλων, προκειμένου να αντιπαρατεθεί για δεύτερη φορά με τον Αλέξανδρο. Εκεί, η τεράστια περσική στρατιά θα μπορούσε να ελιχθεί με άνεση και να εκμεταλλευτεί τον όγκο της. Ο Αλέξανδρος έφθασε στο πεδίο της μάχης στα τέλη Σεπτεμβρίου, αφού οι δυνάμεις του διάβηκαν τον Τίγρη και τον Ευφράτη, χωρίς να συναντήσουν την παραμικρή αντίσταση.
Στο πεδίο της μάχης, ο Δαρείος με τους επίλεκτους οπλίτες του κάλυπταν το κέντρο της παράταξης του περσικού στρατού. Στην αριστερή πτέρυγα είχαν τοποθετηθεί το ιππικό, με επικεφαλής τον σατράπη Βήσσο, και τα δρεπανηφόρα άρματα. Στα δεξιά, ο σατράπης Μαζαίος είχε υπό τας διαταγάς του δυνάμεις ιππικού και χιλιάδες μισθοφόρους, ανάμεσά τους και τους Έλληνες. Ο Αλέξανδρος ανέλαβε τη δεξιά πτέρυγα του στρατεύματός του και ο Παρμενίων την αριστερή.
Ο Αλέξανδρος εφάρμοσε ένα νέο στρατήγημα. Προκάλεσε το ιππικό των Περσών να επιτεθεί πρώτο προς την πλευρά του, με σκοπό να εκμεταλλευθεί το κενό που θα δημιουργηθεί μεταξύ των γραμμών του εχθρού και να επιτεθεί στο κέντρο της παράταξής τους, όπου ευρίσκετο ο Δαρείος με τους επίλεκτους οπλίτες του. Την υλοποίηση του σχεδίου θα αναλάμβαναν οι φάλαγγες και το ιππικό των Εταίρων, που θα σχημάτιζαν μία μεγάλη σφήνα, με τον ίδιο τον Αλέξανδρο στην κορυφή.
Το σχέδιο εκτελέσθηκε κατά γράμμα και ο Δαρείος βρέθηκε απομονωμένος, αφού ο Βήσσος, που κατείχε την αριστερή πτέρυγα, αποκόπηκε και ετράπη σε φυγή. Ακολούθησε ο Δαρείος, τον οποίον, όμως, δεν καταδίωξε ο Αλέξανδρος, καθώς επέλεξε να βοηθήσει τον Παρμενίωνα, που αντιμετώπιζε προβλήματα με τον Μαζαίο και τις δυνάμεις του. Όμως, ο πέρσης σατράπης γρήγορα αντελήφθη το μάταιο της προσπάθειάς του και υποχώρησε με τις δυνάμεις του.
Οι Πέρσες άφησαν ανυπολόγιστο αριθμό νεκρών επί του πεδίου της μάχης, ενώ οι Μακεδόνες από 100 έως 3.000, σύμφωνα με τις διάφορες πηγές. Οι άνδρες του Αλέξανδρου πήραν ως λάφυρα 4.000 τάλαντα από τη σκηνή του Δαρείου, το άρμα του και το προσωπικό του τόξο, καθώς και τους πολεμικούς ελέφαντες, που δεν έπαιξαν κανένα ρόλο στη μάχη.
Ο Αλέξανδρος μπήκε θριαμβευτικά στη Βαβυλώνα και ανακηρύχθηκε «Μεγάλος Βασιλεύς». Ο Δαρείος κατέφυγε στα βουνά της Μηδίας, με σκοπό να ανασυγκροτήσει τον στρατό του και να επιτεθεί εκ νέου στον Αλέξανδρο. Δεν πρόλαβε, καθώς ο Βήσσος, που εποφθαλμιούσε το θρόνο, τον έπιασε αιχμάλωτο και τον σκότωσε το 330 μ.Χ. Ήταν, όμως, αργά γι’ αυτόν .Ο Αλέξανδρος ήταν ο κυρίαρχος της Ασίας και της Μεγάλης Περσικής Αυτοκρατορίας.