Ήταν η δεύτερη προσπάθεια των Οθωμανών το 1522 να εκδιώξουν τους Ιωαννίτες Ιππότες από τη Ρόδο και να διασφαλίσουν με την κατάληψη του νησιού την κυριαρχία τους στο νοτιοανατολικό Αιγαίο. Αυτή τη φορά στέφθηκε από επιτυχία, σε αντίθεση με την πρώτη το 1480.
Ο 16ος αιώνας ήταν η περίοδος της μεγίστης ακμής για την Οθωμανική Αυτοκρατορία, υπό την ηγεσία του σουλτάνου Σουλεϊμάν Α’ του Μεγαλοπρεπή. Τη Ρόδο κατείχαν από το 1309 οι Ιωαννίτες Ιππότες (Τάγμα του Αγίου Ιωάννη), απομεινάρια των Σταυροφόρων, που είχαν χάσει και τα τελευταία τους ερείσματα στους Αγίους Τόπους το 1291. Αγόρασαν την πόλη της Ρόδου από τους Γενουάτες και κατόρθωσαν να επεκτείνουν την κυριαρχία τους σε όλο το νησί, εκδιώκοντας τους Τούρκους. Με την πάροδο των ετών δημιούργησαν ένα ισχυρό προπύργιο στην περιοχή και κατέστησαν αρκετά ενοχλητικοί για τους Οθωμανούς, αφού παρεμπόδιζαν με τις επιδρομές τους τη ναυσιπλοΐα από τη Βαλκανική και τη Μικρά Ασία προς τα λιμάνια της Συρίας και της Αιγύπτου.
Μετά την αποτυχημένη πολιορκία της Ρόδου από τους Οθωμανούς το 1480, ήταν θέμα χρόνου η επάνοδός τους στο νησί. Για αυτό, το κύριο μέλημα του Μέγα Μάγιστρου Φιλίπ Βιλιέ ντε Λιλ Αντάμ ήταν να βελτιώσει και να επεκτείνει τα οχυρωματικά έργα της πόλης και να κλείσει το λιμάνι με την τοποθέτηση μιας τεράστιας σιδερένιας αλυσίδας στην είσοδό του. Ο Σουλειμάν, από την πλευρά του, αποφάσισε ότι το καλοκαίρι του 1522 ήταν ο καλύτερος χρόνος για να επιχειρήσει την κατάληψη της Ρόδου.
Στις 26 Ιουνίου, ο στόλος του, αποτελούμενος από περίπου 280 πλοία, αποβίβασε τα πρώτα στρατεύματα στη Ρόδο.
Μέχρι τις 28 Ιουλίου, οπότε κατέφθασε αυτοπροσώπως ο Σουλτάνος για να εποπτεύσει την επιχείρηση, ο αριθμός τους έφθανε τις 100.000 άνδρες. Επικεφαλής των τουρκικών δυνάμεων τέθηκε ο μπατζανάκης του Σουλτάνου, Μουσταφά Πασά. Την καλά οχυρωμένη πόλη της Ρόδου υπερασπίζονταν περίπου 5.000 άνδρες, από τους οποίους οι 600 ήταν του Τάγματος (200 Ιππότες), 400 Κρητικοί (Έλληνες και Βενετοί, ανάμεσά τους και ο μεγάλος τειχιστής Γαβριήλ Μαρτινέγκο) και οι υπόλοιποι ξένοι ναυτικοί και ντόπιοι Ροδίτες.
Η πολιορκία της Ρόδου βάστηξε πέντε μήνες και θεωρείται μία από τις σημαντικότερες στρατιωτικές επιχειρήσεις του είδους. Στην αρχή, ο Μουσταφά Πασάς μπλόκαρε το λιμάνι και βομβάρδισε την πόλη με το πεδινό πυροβολικό του. Στη συνέχεια, οι επιθέσεις του πεζικού ήταν καθημερινό φαινόμενο, αλλά απέβαιναν άκαρπες. Το φρούριο της Ρόδου κρατούσε γερά και δεν ήταν εύκολη υπόθεση η κατάληψή του, όπως πίστευαν αρχικά οι σύμβουλοι του Σουλτάνου. Στις 24 Σεπτεμβρίου ο Μουσταφά πραγματοποίησε μια συνδυασμένη μαζική επίθεση με πυροβολικό και πεζικό. Πάνω στα τείχη της Ρόδου διεξήχθησαν ομηρικές μάχες και πολλές φορές άλλαξαν χέρια. Μία μέρα αργότερα και αυτή η επίθεση κατέληξε σε αποτυχία, με σημαντικές απώλειες για τους επιτιθέμενους.
Εξοργισμένος ο Σουλεϊμάν από την ανικανότητα του στρατηγού του διέταξε να τον θανατώσουν και ανέθεσε την επιχείρηση στον Αχμέτ Πασά, έμπειρο πολιορκητή και με γνώσεις μηχανικής. Μόνο με την παρέμβαση των συμβούλων του η οργή του Σουλτάνου καταλάγιασε και χαρίστηκε στον συγγενή του. Ο Αχμέτ με τα διαρκή πυρά του πυροβολικού του προξένησε σημαντικές ζημιές στις οχυρώσεις, ενώ προσπάθησε να σκάψει λαγούμια κάτω από τα τείχη και να αιφνιδιάσει τους αμυνόμενους. Μια νέα επίθεση τον Νοέμβριο κατέληξε σε αποτυχία.
Και οι δύο πλευρές, μετά από πέντε μήνες άγριων μαχών, είχαν φθάσει στα όριά τους. Σε πιο δεινή θέση ήταν οι πολιορκούμενοι, που αντιμετώπιζαν έλλειψη τροφών και πολεμοφοδίων, αφού η βοήθεια από τη Δύση δεν έφθασε ποτέ. Οι οχυρώσεις καταστρέφονταν, χωρίς δυνατότητα επισκευής. Ο αποδεκατισμός της φρουράς δεν ήταν δυνατόν να αντιμετωπισθεί, ενώ αντίθετα στο τουρκικό στρατόπεδο οι τρομακτικές απώλειες αναπληρώνονταν με αφίξεις νέων στρατευμάτων.
Υπό την πίεση του λαού, ο Μέγας Μάγιστρος ζήτησε ανακωχή από τον Σουλτάνο στις 20 Δεκεμβρίου 1522. Δύο μέρες αργότερα, ο Σουλεϊμάν δέχθηκε και ανακοίνωσε τους όρους του, οι οποίοι ήταν αρκούντως γενναιόδωροι και εξέπληξαν τους αμυνόμενους. Ο Σουλεϊμάν απαίτησε από τους Ιππότες να εγκαταλείψουν τη Ρόδο εντός 12 ημερών με την περιουσία και τον οπλισμό τους. Στους ντόπιους, Έλληνες και Λατίνους, έδωσε φορολογική απαλλαγή για πέντε χρόνια και παρείχε τη διαβεβαίωση ότι δεν θα μετέτρεπε τους χριστιανικούς ναούς σε τζαμιά. Αν ήθελαν να εγκαταλείψουν το νησί όφειλαν να το πράξουν εντός τριών ετών.
Την 1η Ιανουαρίου 1523 οι Ιππότες και αρκετοί Έλληνες εγκατέλειψαν τη Ρόδο με προορισμό τη βενετοκρατούμενη Κρήτη. Στη συνέχεια, οι Ιππότες διεκπεραιώθηκαν στη Σικελία και κατέληξαν στη Μάλτα, όπου θα μετονομαστούν σε Ιππότες της Μάλτας και θα τεθούν εκ νέου αντιμέτωποι των Οθωμανών το 1565.
Εν τω μεταξύ, στη Ρόδο ξέσπασαν οι πρώτες ταραχές, όταν οι νικητές έδιωξαν Λατίνους και Έλληνες από το φρούριο, στο οποίο εγκαταστάθηκαν Τούρκοι και Εβραίοι. Η πολιορκία και η άλωση της Ρόδου επιτεύχθηκε με μεγάλο ανθρώπινο κόστος για τους Οθωμανούς (περίπου 50.000 οι νεκροί και οι τραυματίες), αλλά τους διασφάλισε την κυριαρχία τους στο Νοτιοανατολικό Αιγαίο.